Общие принципы Под детерминацией понимают процесс выявления среди различных возможностей, к которым компетентна клеточная система, одного специфического пути дифференцировки. В настоящее время теория предполагает, что выбор этого пути основывается не на различиях в генетическом наборе клеток. Можно доказать эквивалентность клеточных ядер и одновременно продемонстрировать, как дифференцировки в цитоплазме индуцируют разную активность генов. Яйцеклеткам, цитоплазма которых еще до начала дробления организована таким образом, что детерминирующие вещества и структуры образуют четко заданный план строения, свойствен мозаичный тип развития. При этом разные типы цитоплазмы, окружающие клеточное ядро более или менее жестко определяют направления дифференцировки, допускающие лишь ограниченные варианты. Такому онтогенезу можно противопоставить регуляционный тип развития. В этом случае четко установлены лишь неко-торые параметры будущего организма. Возникшие в результате дробления и гаструляции малодифференцированные клетки еще обладают достаточно широкой компетенцией. Детерминация у таких зародышей определяется, как правило, индукционными влияниями между различными первичными закладками. Положение клеток в системе градиента веществ также часто задает направление их дифференцировки. Эквивалентность и тотипотентность клеточных ядер На разных стадиях развития и в различно дифференцированных клетках активна только определенная часть всех генов (генома) ядра. Опыты по гибридизации РНК и ДНК показывают, что при этом транскрибируются различные группы генов. Однако доказано, что неравномерного распределения наследственного материала или необратимых процессов в самом геноме в данном случае не происходит. Если «гантелевидно» перешнуровать только что осемененную яйцеклетку тритона, то дробится только ее часть, содержащая ядро. Если позднее ослабить лигатуру, ядра начнут мигрировать из раздробившейся области в безъядерный участок цитоплазмы. Там также начинается дробление, и развивается такой же полноценны –двойниковый эмбрион. Значит, при этом ядра (по крайней мере, до стадии 16 бластомеров) еще обладают всеми потенциями развития - они эквивалентны. Опыт по трансплантации ядер показывает, что более поздняя дифференци-ровка тоже не вызывает необратимого изменения ядерных генов. Если энуклеировать яйцеклетку амфибий и ввести в нее освобожденное от цитоплазмы ядро полностью дифференцированной клетки кишечного эпителия головастика, то это «постаревшее» ядро также обеспечивает полноценное развитие, приводящее в благоприятных случаях к метаморфозу в лягушку. Даже ядра из клеток эпидермиса взрослой лягушки, выращиваемых в культуре ткани, могут обеспечить развитие головастиков с их разнообразными типами клеток, несмотря на то, что исходно эти ядра находились в клетках, специализированных на синтезе рогового вещества кератина. Таким образом, ядра сохраняют функциональную тотипотентность и могут «переключаться» в, цитоплазме яйцеклетки таким образом, что уже завершившаяся программа развития выполняется сначала. Однако возможна и обратная реакция. Гены, ак-тивные в зародыше-доноре, в частности кодирующие рРНК, прекращают работу в цитоплазме дробящейся яйцеклетки («выключаются»). Есть все основания предполагать, что определенные белки или нуклеопро-теины цитоплазмы контролируют активность генов в ядрах клеток. Напри-мер, ядро зрелого эритроцита птиц, полностью прекратившее функционирование, можно активировать путем переноса в цитоплазму клетки мыши. При этом оно вновь начинает кодировать специфический для птиц гемоглобин и образует ядрышки. При детерминации зародышевого пути также оказывается, что дифференцировка эмбриональных клеток определяется веществами цитоплазмы. Мозаичное развитие В яйцеклетке асцидии Cynthia выявляются по меньшей мере четыре хорошо различных типа цитоплазмы, которые после осеменения в результате сегрегации располагаются билатерально симметрично и послойно вдоль полярной оси. Дробление распределяет эти области по бластомерам так, что на стадии 64 клеток они становятся полностью мозаично-обособленными. Каждый из четырех типов клеток вносит свой специфический вклад в развитие основного плана строения. При центрифугировании яйцеклетки вещества цитоплазмы перемешиваются с образованием необычного их распределения. Однако и при нарушенном расположении они, как и прежде, детерминируют определенный тип клеток. В результате дифференцируются зародыши с хаотичным распределением закладок органов. Это является результатом самодифференцировки, протекающей независимо от соседних клеток и зародыша в целом. Если в ходе дробления разделить клетки, они развиваются в те части тела, типы клеток и органы, которые возникли бы при нормальном онтогенезе. Если, например, на двухклеточной стадии развития убить один из бластоме- ров, то из сестринской клетки образуется правая или левая половина зародыша. В таких мозаичных системах проспективные потенции, т. е. возможности развития у различных групп взаимосвязанных малодифференцированных клеток, ограничены их проспективным значением, т. е. дифференцировкой, на которую они запрограммированы в нормальном зародыше. Обусловленная мозаичностью детерминация доказана для многих типов яиц беспозвоночных. У гребневиков полное дробление ведет к стадии 16 клеток с восемью крупными вегетативными и восемью мелкими анимальными бластомерами. В анимальном октете благодаря сегрегации концентрируется часто особым образом пигментированная цитоплазма, которая имеет детерминирующее и вместе с тем формативное значение. Каждая из этих клеток обладает потенцией к образованию одного из восьми ресничных гребней животного. Если разделить бластомеры на этой стадии, возникающее количество гребней соответствует числу оставшихся вместе анимальных клеток. В результате могут получаться неполные личинки с одним, двумя, четырьмя и т. д. гребнями. Особенно убедительно можно доказать органообразующую способность определенных областей цитоплазмы на примере лопатоногого моллюска Dentalium. У него во время двух первых делений дробления возникает по одной полярной лопасти с вегетативной плазмой, которая затем передается только одному из бластомеров. При удалении этих лопастей у трохофорной личинки отсутствуют определенные закладки органов. Эмбриональная регуляция В очень многих развивающихся системах участки яйцеклетки и зародыша обладают проспективной потенцией, значительно превышающей их проспективное значение. Если разделить два первых бластомера зародыша амфибий, которые, развиваясь вместе, дали бы соответственно правую и левую половины тела животного, то из каждого бластомера образуется полноценная личинка, а из нее лягушка или тритон. Таким образом, материал яйцеклетки используется по-новому. При закладке каждой новой плоскости симметрии возникает новый план строения, организация и потенции развития которого приводят к образованию уменьшенной копии нормального зародыша. При таких регуляционных процессах действуют факторы структурированного континуума, которому подчинены реагирующие на него клетки, и происходит дифференцировка, зависящая от окружения. То, что возникающий в результате регуляции план строения не связан с клеточными границами, показывают, в частности, перешнуров¬ки яйцеклеток тритона на стадии ранней гаструлы. Если плоскость разделения совпадает с плоскостью симметрии, то развиваются такие же пропорциональные двойники, как и после изоляции двух бластомеров. Если зародыши частично перешнуровать в медианной плоскости, возникают личинки с удвоенной на том или ином протяжении передней частью тела. Аналогичным образом происходит регуляция ранних стадий развития морского ежа. Если при разделении зародыша сохраняется равновесие между анимальными и вегетативными бластомерами, то даже 1/8 его часть даст целую личинку. Регуляция доказана для всех позвоночных. Если путем точечного облучения у кролика умертвить один из бластомеров на двухклеточной стадии дробления, то неповрежденная вторая клетка разовьется в целое животное. У человека однояйцевые близнецы (не только двойни, но и тройни и т.д.) или парные уродства (сиамские близнецы) возникают после полного или частичного разделения зародыша на ранних стадиях. Пять канадских однояйцевых близнецов (семья Дион) показывают, насколько высока может быть степень эмбриональной регуляции. Кроме регуляции, в результате которой из части образуется уменьшенное целое, возможна и регуляция с возникновением увеличенного целого. Можно объединить клетки двух или более дробящихся зародышей мыши. При этом возникает один нормально организованный гигантский эмбрион, развивающийся в половозрелое животное. Таким способом можно комбинировать клетки с различными генотипами. Дифференцировки возникающих мозаичных мышей дают представление об автономности клеток при формировании признаков, о половом развитии гинандроморфных особей и о возможностях клеточных клонов, произошедших от одной эмбриональной клетки (cell-lineage). Различие между мозаичным и регуляционным развитием относительно. В мозаичном зародыше гребневиков образование отдельных полных структур, например находящегося на апикальном полюсе статоциста, регулируется и при развитии части зародыша. С другой стороны, регуляция у морских ежей и амфибий, как будет показано далее, осуществляется только при наличии определенных областей яйцеклетки. Однако решающим является тот момент, в который клеточная система детерминируется для выполнения специфических функций. Не имеет значения, происходит ли это на ранних этапах развития мозаичного зародыша путем разделения определенных типов цитоплазмы между бластомерами или на более поздних стадиях при регуляционном развитии в результате межклеточных взаимодействий. Этапы, следствия и стабильность детерминации Шпеман (1909-1944), которому мы обязаны созданием микрохирургической методики работы с эмбрионами, показал, когда при развитии амфибий в эктодерме происходит качественная детерминация эпидермиса и нервной ткани. В этих опытах к началу гаструляции участки презумптивного эпидермиса (например, из вентральной области гаструлы) и презумптивной нервной пластинки другого зародыша меняют местами. Имплантаты приживаются и развиваются под влиянием их нового окружения соответственно в мозг или кожу, т.е. согласно местоположению. Таким образом, пересаженные области эктодермы были на этой стадии еще недетерминированы. Если же пересадить эмбриональные закладки из тех же областей после завершения гастру-ляции, когда эктодерму уже подстилает первичная кишка, то имплантаты хотя и приживутся, но будут развиваться согласно своему происхождению. Презумптивный эпидермис станет эпидермисом и на новом месте, а позднее отторгнется мозгом. Презумптивный нейральный материал разовьется в вентральной области в нервную пластинку, погрузится под поверхность и даст ту область мозга, которой бы он стал на прежнем месте. Следовательно, во время гаструляции оба участка эктодермы окончательно детерминированы. В результате детерминации исчезает способность закладок к самодифференцировке. Поэтому в детерминированных эмбриональных закладках, даже если они изолированы и выращиваются как эксплантаты в тканевых культурах, гистогенез протекает до завершения специфически дифференцированной клеточной структуры. Еще в 1907 г. Гаррисон (1870-1959), создатель методики тканевых культур, наблюдал за дифференцировкой in vitro эмбриональных клеток нейральной закладки лягушки. При этом из нейробластов вырастали длинные нервные отростки. Тем самым было доказано, что тело нервной клетки (перикарион) и аксон являются частями одной и той же клетки. В тканевых культурах клетки (например, куриных эмбрионов или раковых опухолей) могут в течение десятилетий неограниченно размножаться. При этом они длительное время сохраняют и воспроизводят свое состояние детерминации, например к дифференцировке эпителиальных, соединительнотканных, сердечномышечных или раковых клеток. Однако такая клеточная наследственность остается стабильной не при любых условиях. Независимо от мутаций в собственно генетическом материале следует помнить, что сама активность генов в особых случаях может изменяться. Это было показано для мозаичных по своему строению имагинальных дисков мух, отдельные группы клеток в которых уже на ранних стадиях детерминированы в сторону начинающихся позднее во время метаморфоза дифференцировок в определенные части тела взрослой особи (имаго). Такие группы клеток можно сколь угодно долго культивировать в брюшке взрослых мух в недифференцированном состоянии. При этом исходное состояние детерминации изменяется с определенной вероятностью и в определенных направлениях. Так, например, детерминация в сторону образования ноги переходит в состояние, которое компетентно только для дифференцировки крыльев или частей головы. Этот феномен, названный трансдетерминацией, вероятно, вызывается изменением скорости пролиферации, что может привести к смещению внутриклеточного равновесия, которое выборочно контролирует функции определенных групп генов. Например, активность «генов ноги» могла бы быть прекращена и заменена активностью «генов крыла». Возможно, при возникновении характерного для раковых клеток поведения также изменяется состояние их детерминации, т.е. типичные для ракового заболевания наследственность и признаки клеток (форма роста, обмен веществ и т.д.) являются, как и при трансдетерминации, результатом замены одной генной активности другой. Правда, это ничего не говорит о первопричинах злокачественного перерождения. Первичный индуктор как организационный центр Так как во время гаструляции в зародыше амфибий устанавливаются важные детерминации, следует показать, что они стимулируются определенными эмбриональными закладками. С этой целью участок ранней гаструлы из презумптивной мезодермальной области, лежащий до гаструляции в виде краевой зоны над верхней губой бластопора, а позднее образующий крышу первичной кишки, пересаживают в область будущего вентрального эпидермиса или в бластоцель. В первом случае имплантат сам инвагинирует , а во втором - придвигается в ходе гаструляции к вентральной эктодерме. Обладая автономными компетенциями, он дифференцируется в хорду и остальную мезодерму, влияя, кроме того, на прилегающие участки зародыша-хозяина. Это воздействие называется индукцией. Имплантированный участок дополняет себя окружающей мезодермой хозяина, поскольку ему не хватает материала для образования первичных сегментов и боковых пластинок. В эктодерме хозяина, расположенной над имплантатом, индуцируется формирование нервной пластинки. При этом энтодерма способна образовать вторичную полость первичной кишки, а в мезодерме, присоединившейся дополнительно к имплантату, могут дифференцироваться канальцы пронефроса. Фрагмент презумптивной мезодермы из краевой зоны организует путем регуляторной самодифференцировки и индукции вторичную эмбриональную закладку, которая располагается билатерально симметрично вдоль новой устанавливающейся оси тела. В этот вторичный эмбрион могут вовлекаться настолько крупные участки зародыша-хозяина, а образующиеся вторичные части тела (голова, туловище, конечности, хвост) могут достигать такой высокой степени внешней и внутренней организации, что реципиент удваивается. Область бластулы-ранней гаструлы, от которой исходят индукционные и организующие влияния, Шпеман назвал «организатором». Клеточный материал этой первичной индукционной системы объединен в организующем центре. Этот центр соответствует мезодерме краевой зоны, инвагинирующей с образованием первичной кишки, которая дифференцируется преимущественно в хорду и мускулатуру. В результате опытов по трансплантации возникает вопрос о значении и необходимости организующего центра при нормальном развитии. Уже непосредственно после осеменения в сером серпе яйцеклетки лягушки заметно концентрируется цитоплазма, которая позднее войдет в состав краевой зоны . Таким образом, ее индукционные потенции восходят к предетерминированной геномом материнского организма функциональной структуре яйцеклетки. Облучение серого серпа ультрафиолетовыми лучами в еще нераздробившейся яйцеклетке приводит позднее к утрате эмбриональной индукции, и возникают зародыши без нервной системы. Ультрафиолетовое облучение поражает не ядра (это доказано их трансплантацией), а цитоплазму яйцеклетки. Эффект облучения может быть устранен путем инъекции цитоплазмы из области серого серпа необлученного донора. Если яйцеклетки тритонов на какой-либо ранней стадии до начала гаструляции перешнуровывать пополам, то развитие до целого регулируется только у тех их половин, которым досталось необходимое количество клеточного материала из краевой области. На-пример, после фронтального разделения материалом индуктора обеспечивается только дорсальная часть бластулы. Только она проходит впоследствии гаструляцию и регулируется с образованием нормальной личинки. Хотя вентральный «близнец» и продолжает жить, у него отсутствуют осевые органы (нервная трубка, хорда и сомиты), и в результате развивается только аморфный брюшной фрагмент, состоящий из богатых желтком клеток энтодермы и покровной эктодермы. Бывают случаи, когда и у человека наряду с нормальным близнецом рождается «аморфный». То, что крыша первичной кишки, являясь первичным индуктором, необходима для нормального развития, вытекает из экспериментов с «сэндвичевыми» комбинациями эмбриональных закладок. Изолируется еще недетерминированная эктодерма ранней гаструлы. В культуральном растворе кусочек из области организатора помещают на кусочек эксплантата, который быстро окружает «начинку» . В результате в презумптивной эктодерме индуцируются самые разнообразные органы и нормальные ткани, прежде всего-части нервной системы. Контрольный эксплантат развивается в образование, состоящее только из расположенных в форме тяжей атипичных эпидермальных клеток. Следовательно, без влияния крыши первичной кишки не может произойти детерминация в направлении нервной ткани, что можно видеть и на примере «брюшного фрагмент. Индукционное влияние начинается в ходе гаструляции, когда эктодерма подстилается крышей первичной кишки, и продолжается до завершения нейруляции. Видовая неспецифичность индукции Если имплантировать материал крыши первичной кишки лягушки (Rana) или жерлянки (Bombina) в зародыш тритона (Triturus), то индукция протекает так же, как у вида-донора. Такая видовая неспецифичность наблюдается и для более далеких филогенетически групп. Материал организатора амфибий, рыб или млекопитающих может индуцировать в зародышевом диске цыпленка появление дополнительной эмбриональной закладки. Даже экстракты из тканей взрослых птиц и млекопитающих индуцируют формирование определенных частей тела в зародыше амфибий. Очевидно, у всех позвоночных детерминация в направлении нервной системы происходит с помощью сходных механизмов и за счет одинаковых или взаимозаменимых веществ, т.е. индукторы в широких границах действуют, как и гормоны, невидоспецифично. Видовая специфичность нормы реакции От головной области эмбриона хвостатых амфибий (тритона) исходит видоспецифичное индукционное воздействие, вызывающее в имплантате, взятом от бесхвостых амфибий (лягушки или жерлянки), образование ротовых структур и органов прикрепления. Однако выполнение этого «задания» осуществляется в соответствии с генотипом реагирующих клеток. В результате на голове тритона образуются типичные для бесхвостых амфибий роговые челюсти и присоски. В опытах с реципрокными пересадками голова головастика вооружается эпидермальными органами хвостатых амфибий, т.е. настоящими челюстными зубами и личиночными органами осязания - балансирами. Таким образом, генетически обусловленная норма реакции реализуется автономно. Это наблюдается и во многих других экспериментах по транс-плантации, когда активирующая и реагирующая системы принадлежат генетически различным особям (мутантам, видам). Регионарная специфичность индукторов В результате индукции крышей первичной кишки в передней части нервной пластинки образуется головной мозг, а за ним спинной. Эксперимент доказывает регионарную неоднородность самой крыши первичной кишки. К такому же результату приводят опыты по «сэндвичевому» совмещению эмбриональных зачатков. «Начинка» из мезодермы, которая стала бы головным участком крыши первичной кишки, индуцирует формирование частей мозга, глаз и балансиров. И напротив, материал из презумптивной туловищной части крыши первичной кишки индуцирует в эктодерме возникновение спинного мозга, мускулатуры туловища, края плавника и частей хвоста. Регионарная специфичность влияния доказана и для экстрактов органов взрослых морских свинок. Этими веществами можно пропитать кусочки агара, которые вводятся в бластоцель так же, как и клеточные имплантаты, и отдают там свои вещества реагирующей ткани. Экстракты печени индуцируют преимущественно образование участков переднего мозга, экстракты почек - образование продолговатого и спинного мозга, а экстракты костного мозга в большинстве случаев - мезодермальных органов туловища (мускулатуры и т.д.). Иерархия индукционных систем В пространстве и во времени образование закладок органов управляется (прежде всего в эмбриогенезе позвоночных) последовательностью индукционных процессов. При этом малодифференцированные эмбриональные ткани, специализировавшиеся под действием индукторов более высокого порядка, начинают действовать как индукторы низшего порядка Иерархическая последовательность запускает регуляторные механизмы, обеспечивающие совпадение во времени действия индуктора и способности воспринять его (компетенции) реагирующей системы. Для этого необходимо, чтобы в обоих системах вовремя включались или, соответственно, выключались специфические для данной фазы наборы генов. Мутации могут нарушить функционирование различных компонентов иерархических систем. Относительно часто у позвоночных наблюдаются уродства головной области, например, микроцефалия, анэнцефалия (отсутствие головного мозга) или микрофтальмия (уменьшение глаза). При этом следует решить, на что первично влияет мутация: на индуктор первого порядка (крышу головной кишки) или на реагирующую систему (нейральную эктодерму). Эти уродства можно фенокопировать в результате облучения или химической обработки материала организатора. При летальной мутации мыши, у которой отсутствует тазовая почка, индуцирующий ее отросток мочеточника недоразвивается и не доходит до реагирующей на него системы в мезодерме боковой пластинки. В данном случае дефект мочеточника следует считать аутофеном, а отсутствие тазовой почки – аллофеном. Механизмы индукционного воздействия Индукция крышей первичной кишки осуществляется только в том случае, если после инвагинации возник тесный поверхностный контакт между ней и эктодермой. После определенной длительности воздействия, которая варьирует в зависимости от вида от нескольких минут до 16 ч, индуктор может быть удален, поскольку детерминация нейральной дифференцировки уже стала стабильной. Эмбриональные ткани способны реагировать на индукционные воздействия только в течение ограниченного периода. Такая компетенция приобретается презумптивной нейральной эктодермой только с наступлением гаструляции и исчезает, когда контрольные зародыши завершают нейруляцию. Для некоторых дифференцировок необходимо взаимодополняющее влияние нескольких активирующих систем. Это показано, в частности, на примере индукции хрусталика у позвоночных. Хрусталик образуется в области соприкосновения эмбрионального глазного бокала с покровной эктодермой. Однако еще раньше на стадии ранней гаструлы энтодерма головной кишки как первая активирующая система стимулирующе воздействует на презумптивную закладку хрусталика. Затем на стадии поздней гаструлы это воздействие усиливается презумптивной мезодермой сердца. Только после нейруляции глазной бокал начинает действовать как третья активирующая система. У представителей родов Triturus и Ambystoma в основном необходима третья фаза индукционного процесса. При отсутствии глазного бокала хрусталик не может образоваться, однако глазной бокал способен индуцировать его появление и на необычном месте, например в области вентрального эпидермиса. И напротив у прудовой лягушки (Rana esculenta) даже после удаления за-кладки глазного бокала, по-видимому, возможна самодифференцировка хрусталика. Очевидно, здесь достаточно предыдущих фаз индукционного воздействия. Для развития обонятельного эпителия обонятельной ямки и для дифференцировки слухового пузырька также показана многоступенчатая индукция. Во многих случаях индуцируемые закладки оказывают обратное влияние на свои индукторы. Такие взаимодействия между активирующей и реагирующей системами наблюдаются, например, при реакции между глазным бокалом и хрусталиком. Закладка последнего при этом обеспечивает нормальную дифференцировку сетчатки глаза. Взаимодействие необходимо и при развитии конечностей у позвоночных. Утолщение эктодермы (образование эпидермального гребня) на дистальном конце почки ноги или крыла необходимо в качестве индуктора для пролиферативного роста мезодермы. В то же время эпидермальный гребень сохраняется только при стимулирующем влиянии на него мезодермы. Несмотря на многолетние исследования, основные вопросы, связанные с индукционными механизмами, не решены до настоящего времени. Едва ли можно оспаривать тот факт, что ткани индуктора выделяют специфические вещества, переходящие в реагирующие закладки. Так, например, если поместить непроницаемую мембрану между крышей первичной кишки и эктодермой, то индукции не произойдет. И напротив, фильтр с диаметром пор 0,8 мкм не препятствует переходу веществ от индуктора к индуцируемой ткани. Правда, в последнее время с помощью электронной микроскопии было показано, что через поры фильтра проникают тончайшие нити цитоплазмы. Вероятно, даже при отсутствии прямого клеточного контакта индуктор отделен от реагирующей системы лишь очень небольшим промежутком. Возможно, индуцирующие вещества сначала выделяются в межклеточное пространство. О природе индуцирующих веществ, действующих при нормальном развитии, нет единой точки зрения. Правда, из куриного эмбриона удалось выделить в чистом виде белок, который индуцирует формирование мезодермальных органов у зародыша амфибий, например мускулатуры и хорды туловищно-хвостовой области. Вероятно, индукцию в головной области также вызывают белки, однако преобладает точка зрения, что для регионарной специфичности воздействия они должны образовать комплексы с молекулами РНК. Существует мнение, что в промежуточной области, где индуцируется формирование продолговатого мозга, головные и туловищные индукторы действуют совместно. Полагают, что «туловищное» влияние здесь ослабляется, сменяясь возрастающим влиянием головного отдела. О молекулярных механизмах индукции в настоящее время ничего конкретного неизвестно. Возможно, для дифференцировки в заданном направлении необходима работа определенных групп генов. Это могло бы объясняться как активацией уже существующих, но «замаскированных» молекул мРНК, так и включением новых процессов трансляции.
Форум
