ТЕРМОФИЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ Экологически обособленную группу в природе представляют термофильные микроорганизмы. Температурные условия вызывали в в процессе эволюции появление микробных форм, которые оказались способными развиваться при разных температурах, в том числе и при высокой (50—93 °С). Видная роль в изучении термофильных микроорганизмов принадлежит А. А. Имшенецкому, Е. Н. Мишустину, Б. JI. Исаченко и др. Эти ученые не ограничились разработкой только теоретической стороны проблемы явления термофилии, и их исследования имели важное практическое значение. Одна из главных отличительных особенностей термофилов — ускоренный обмен веществ. За последние годы благодаря новейшим методам исследования удалось накопить данные, частично раскрывающие механизмы, при помощи которых клетка защищается от воздействия высокой температуры. Установлено, что наиболее существенные изменения под воздействием высокой температуры претерпевают клеточные белки и липиды, с которыми связаны основные жизненные процессы. Благодаря высокой скорости роста термофильные микроорганизмы могут найти широкое применение в самых различных отраслях промышленности и сельского хозяйства. Методы выделения термофильных и мезофильных бактерий в основном сходны. Различие заключается лишь в температуре выращивания. Для того чтобы точно установить оптимальную температуру развития и закрепить ее, культуру необходимо длительно (1 — 2 месяца) пассировать (пересевать) в диапазоне найденного оптимума.
Температурные группы микроорганизмов Термотолерантность и термоустойчивость Различные микроорганизмы могут развиваться при разных температурах: одни микробы хорошо растут при низких температурах, близких к 0 °С (+5 °С); другие, наоборот, способны к росту при высоких температурах (около 90 °С). Поэтому микроорганизмы делят по их отношению к температуре на три основные группы — психрофилы, мезофилы и термофилы. Психрофилы (предпочитающие низкие температуры) — микроорганизмы, имеющие минимальную температуру роста ниже 0 °С. Мезофилы (предпочитающие средние температуры) — микроорганизмы, имеющие минимальную температуру роста выше, чем у психрофилов, а максимальную температуру ниже, чем у термофилов. Большинство микроорганизмов — мезофилы, растущие обычно при температурах от 0—10 °С до 40—45 "С. Термофилы (предпочитающие высокие температуры) — микроорганизмы с максимальной температурой роста обычно выше 50 °С. Что же такое минимальная и максимальная температуры роста? Минимальная — это такая пороговая температура, при незначительном снижении которой скорость роста микроорганизма (прирост клеток за 1 ч) близка к нулю, т. е. практически рост прекращается. Максимальная температура — пороговая температура, при незначительном повышении которой скорость роста микроорганизма близка к нулю. При изучении особенностей каждого нового штамма обязательно определяют и оптимальную температуру, т. е. устанавливают тот температурный диапазон, в котором данный микроорганизм растет с максимальной скоростью. При максимальной скорости роста микроорганизм, естественно, наиболее интенсивно размножается. Поэтому довольно часто скорость роста выражают как число генераций за 1 ч. Английский ученый Т. Д. Брок предложил схему, показывающую зависимость скорости роста (частоты генераций) от температуры для различных температурных групп микроорганизмов. Внутри группы термофилов различают еще четыре более мелкие подгруппы — экстремально термофильные микроорганизмы, стенотермофилы, эвритермофилы, термотолерантные микроорганизмы (термотолеранты). Экстремально термофильные микроорганизмы вовсе не растут при температурах ниже 40—45 °С, оптимальная температурная зона роста — около 80 °С, максимальные температуры близки к 93 °С. Стенотермофилы характеризуются минимальными температурами роста, равными 37—40 °С, максимальные лежат в области 70— 80 °С, зона оптимальных температур — 55— 65 °С. Наибольшее количество термофильных микроорганизмов относится к подгруппам эвритермофилов и термотолерантов. Эти подгруппы довольно сложно четко охарактеризовать. Особенно трудно отличить термотолерантные штаммы от некоторых мезофилов. Эвритермофилы имеют минимальную температуру роста ниже 37 °С, а максимальную — выше 48 °С,. но ниже 70 °С. Эта подгруппа включает представителей различных систематических групп — бактерий, актиномицетов, дрожжей, грибов, водорослей. Термотолеранты характеризуются максимальной температурой роста, равной 45—48 °С (для бактерий). Однако некоторые мезофильные штаммы также могут иметь максимальную температуру, равную 45 °С. В таких случаях отличить термотолерантный штамм от мезофильного можно по изменению величины скорости роста при незначительном (на 3—6°) сдвиге температуры в сторону возрастания от значения температур, являющихся оптимальными для мезофильных штаммов бактерий (обычно 37 °С). При таком увеличении температуры скорость роста термотолерантного микроорганизма существенно не изменится, а мезофильный штамм будет развиваться с заметно снижающейся скоростью. Если микроорганизм окажется эвритермофильным (со сравнительно низкой максимальной температурой 48—50 °С), то его скорость роста при повышении температуры от 37 до 43 °С резко возрастет. Таким образом, по изменению скорости роста можно установить принадлежность данного штамма микроорганизма к той или иной температурной группе или подгруппе. Итак, термотолерантный микроорганизм способен размножаться с почти одинаковой скоростью как при обычной температуре (37 °С), являющейся оптимальной для мезофильных штаммов, так и при более высокой (на 3—7° выше) температуре. Термотолерантный микроорганизм как бы безразличен к такому изменению температуры. Да и сам термин «термотолерантность» означает терпимость к повышению температуры. Следовательно, под термотолерантностью следует понимать способность микроорганизма размножаться без существенного уменьшения или увеличения скорости роста при указанном выше увеличении температуры. В природе и лабораторных условиях микроорганизмы могут подвергаться кратковременному воздействию высоких температур. Во время такого теплового воздействия клетки обычно не размножаются. После прекращения действия этого неблагоприятного для развития микроорганизма фактора одни штаммы могут сохранить репродуктивную способность (способность к размножению), другие оказываются менее устойчивыми и погибают. Устойчивость микроорганизмов различных температурных групп (психрофилов, мезофилов, термотолерантов, термофилов) к кратковременному воздействию высоких температур без повреждения репродуктивной способности микроорганизма (при снятии действия этих температур) целесообразно характеризовать термином термоустойчивость (терморезистентность).
Причины, обусловливающие способность термофилов существовать при высоких температурах Многие ученые давно пытались установить, почему термофильные микроорганизмы могут существовать при таких высоких температурах, как 50—90 °С. Оказалось, что как структурные и клеточные элементы, такие, как оболочка, мембраны, рибосомы, так и входящие в состав клетки протеины, жиры, ферменты заметно отличаются качественно и количественно от подобных клеточных компонентов мезофильных форм. Выяснилось также, что если некоторые элементы клетки недостаточно стабильны к высокой температуре (например, рибонуклеиновые кислоты), то их синтез в клетке осуществляется с большей скоростью. В этом процессе участвуют ферменты, отличающиеся высокой термостабильностью. Оболочка клетки термофилов также обладает заметной устойчивостью к действию температуры. Это обусловлено ее химическим составом и более устойчивым к температуре механизмом (чем у мезофилов), осуществляющим синтез клеточных стенок. Дж. Т. Форрестер и А. Дж. Вике н показали, что содержание липидов в клеточных стенках термофилов выше, чем в стенках большинства мезофилов. В клеточных стенках Вас. coagulans, выращенных нри 55 °С, обнаружен необычный полимер, подобный тейхоевой кислоте. Значительный интерес представляют ранние исследования X. Коффлера, который показал, что клеточные белки, выделенные из жгутиков термофилов, более термостабильны, чем белки, выделенные из жгутиков мезофильных форм микробов. Американский исследователь Т. Д. Брок высказал мнение о решающей роли клеточной мембраны в предохранении клетки от теплового повреждения. Некоторые исследователи выдвигают предположение, что состав мембранных липидов определяется максимальной или минимальной температурой роста микроорганизмов. Так, показано, что среди мембранных липидов Bacillus stearothermophilus преобладают жирные кислоты с более длинными и разветвленными цепочками (С15 и С17). Вероятно, эти кислоты могут придавать большую упругость мембранной структуре. Помимо качественных различий в химическом составе клеточных мембран, клетки термофильных бактерий содержат больше мембран, чем клетки мезофильных бактерий. X. Б о д м а н и Н. Е. Велкер нашли увеличение количества мембран в клетках Вас. stearothermophilus при повышении температуры роста. Так, при температуре роста Вас. stearothermophilus 55 °С на долю мембран приходилось 16,5 %, а при 65 °С — 17,8% от сухой массы клеток. Также было отмечено, что с повышением температуры роста указанной культуры от 55 до 65 °С отношение протеинов к липидам в мембранах возрастает от 3,65 до 5,22 соответственно. Клеточные мембраны могут иметь различное строение у разных групп микроорганизмов. Так, например, известно, что у грамотрицательных бактерий мезосомы менее развиты, чем у грамположительных. Возможно, поэтому основные виды облигатных термофильных бактерий грамположительны. Мембраны в клетке служат не только границей раздела фаз, но и местом локализации ряда важнейших биологических систем. В настоящее время имеются данные, указывающие, что некоторые ферменты термофилов приобретают термостабильпость, когда они связаны с клеточной мембраной. Если их отделить от мембраны с помощью ультразвука, то эти ферменты становятся относительно термолабильными. Было .показано, что многие облигатно-термофильные бактерии (Вас. stearothermophilus, Вас. coagulans, Вас. denitrificans) способны образовывать шаровидные протопласты при развитии сначала в интенсивно аэрируемой среде, а затем (в фазе экспоненциального роста) без аэрации. Одним из главных факторов, вызывающих процесс образования протопластов, является резкий дефицит кислорода в среде. Образовавшиеся в этих условиях протопласты могут длительное время, не лизироваться в обычных условиях, что свидетельствует об их значительной осмотической устойчивости. Рибосомы, выделенные из клеток облигатнотермофильных бактерий, обладают значительно большей термостабильностью, чем рибосомы, выделенные из клеток мезофильных форм. Высказывается предположение, что наибольшая стабильность рибосом у термофилов может быть благодаря различиям в составе и структуре рибосомальных протеинов. Интересно привести данные, полученные при изучении термостабильности рибосом у Thermus aquaticus, оптимальная температура роста которой равна 70 °С. Рибосомы грамотрицательной палочки Thermus aquaticus были устойчивы при нагревании до 79 °С, а рибосомы Bacterium coli разрушались при увеличении температуры до 59 °С. Температура денатурации рибосом Т. aquaticus коррелирует с максимальной температурой роста этой бактерии, также равной 79 °С. Рибосомы грамположительной термофильной бациллы Вас. stearothermophilus денатурировались при температуре 72 °С. Химический, состав рибосом Т. aquaticus следующий: 59% белка и 41% РНК. По процентному содержанию этих компонентов рибосомы Т. aquaticus заметно отличались от рибосом грамотрицательной бактерии В. coli, которая состояла из 41% белка и 59% РНК. Увеличение содержания белка, по-видимому, обеспечивает повышенную термостабильность рибосом культуры Т. aquaticus. При изучении нуклеотидного состава рибосомальной РНК, выделенной из клеток Т. aquaticus, Вас. stearothermophilus и В. coli, было выявлено повышенное содержание гуанина и цитозина в молекуле РНК Т. aquaticus и Вас. stearothermophilus по сравнению с РНК, выделенной из В. coli. Рибосомальная РНК, выделенная из клеток термофильных бактерий, более устойчива к действию рибосомальной рибонуклеазы, чем РНК, выделенная из мезофильных форм микроорганизмов. Интересно было сравнить термоустойчивость рибосом Т. aquaticus и В. coli с терморезистент ностью выделенных из этих рибосом рибосомальных РНК. Отмечено, что, хотя рибосомальная РНК Т. aquaticus более термоустойчива, чем р-РНК В. coli, обе изолированные из рибосом р-РНК были значительно менее термостабильными, чем интактные рибосомы этих же микроорганизмов. Те клеточные элементы, которые у термофилов термолабильны (транспортная РНК), способны быстро восстанавливаться после их разрушения или инактивации. В. Бабела и И. Холдстворт установили, что оборачиваемость т-РНК в клетках термофилов гораздо выше, чем у мезофильных форм; этим обеспечивается более высокая скорость синтеза протеинов термофилами. По данным СМ. Фридман и И. Б. Вайнштейн, фермент аминоацил-тРНК-синтетаза, выделенный из термофильной бактерии Вас. stearothermophilus, обладает высокой термостабильностью, сама же т-РНК термолабильна. Таким образом, клетки термофилов способны к быстрому ресинтезу разрушенных и инактивированных клеточных компонентов. С другой стороны, т-РНК экстремально-термофильной бактерии Т. aquaticus была более термостабильной и не подвергалась денатурации при 68 °С, в то время как т-РНК В. coli была стабильной только до 55 °С. Вероятно, высокая термостабильность т-РНК Т. aquaticus, так же как и р-РНК, связана с повышенным содержанием в ее молекуле гуанина и цитозина в сравнении с более низкими концентрациями этих оснований в т-РНК В. coli и Вас. stearothermophilus. Различные ферментные системы, а также отдельные ферменты термофилов неодинаково устойчивы к действию высокой температуры. Наиболее устойчивы гидролитические ферменты. По степени термостабильности Л. Л. Кэмпбелл и Б. Пейс разделяют ферменты на три группы. Среди них наиболее стабильными являются а-амилаза, протеаза, ферменты, активирующие аминокислоты. Высокой терморезистентностью отличаются аминоацилирующие ферменты, принимающие участие в синтезе белка экстремально-термофильной бактерии Т. aquaticus. Эти ферменты были более термостабильными и биологически активными при оптимальной температуре их действия, равной 70°С, чем те же ферменты В. coli при 45 °С. На высокую степень биологической активности аминоацилсинтетаз Т. aquaticus указывает тот факт, что процесс аминоацилирования у Т. aquaticus заканчивается в первые 3 мин, а у В. coli полное аминоацилирование наступало через 6 мин. Эти данные согласуются с результатами исследователей, изучавших свойства аминоацил-т-РНК-синтетаз облигатно-термофильной бактерии Вас. stearothermophilus. Этот фермент был биологически активен при более высокой температуре (55 °С), чем взятый для сравнения фермент из В. coli (37 °С). Однако некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что высокий температурный оптимум для аминоацилирования у Вас. stearothermophilus не является необходимым. Б. Бабела и И. Холдсворт сообщили о потере 50% активности аминоацилсинтетазы Вас. stearothermophilus после инкубирования этого фермента при температуре 60 °С в течение 10 мин. Термостабильность аминоацилсинтетазы Вас. stearothermophilus оказалась низкой при температуре, близкой к оптимальной температуре роста указанного микроорганизма. В противоположность этому у Т. aquaticus обнаружена хорошая корреляция между температурным оптимумом аминоацилирования и оптимальной температурой роста, равной 70 °С. Из экстремально-термофильной бактерии (штамм АТ-62) был выделен фермент аспартокиназа. Этот фермент катализирует образование таких аминокислот, как лизин, треонин и изолейцин. Аспартокиназа очень термостабильна. Максимально активен этот фермент при 70 °С, что коррелирует с оптимальной температурой роста указанного штамма бактерии. Фермент фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза был выделен из бактерии Т. aquaticus. Температурный оптимум действия этого фермента около 95 °С; он стабилен при 80 °С в течение 1 v в отсутствие субстрата и при низкой концентрации белка. Значительный интерес представляет сравнение терморезистентности фруктозо-1,6-дифосфатальдолаз, выделенных из клеток Т. aquaticus и Вас. stearothermophilus. Оба фермента термостабильны, но фермент, выделенный из Т. aquaticus, был более устойчив к прогреву. Так, указанный фермент, выделенный из Вас. stearothermophilus, инактивировался при 75 °С, а фермент, выделенный из клеток Т. aquaticus УТ-1, был стабилен при 97 СС. Ферменты гликолитического превращения глюкозы — фосфофруктокиназа и фосфоглюкомутаза — были выделены японскими исследователями из клеток экстремально-термофильной бактерии Flavobacterium thermophilus НВ-8. Эти ферменты термостабильны. Так, фосфофруктокиназа не инактивировалась в течение 1 ч при 80 °С, и за то же время потеря активности составила всего 10% при температуре прогрева, равной 90 °С. Фосфоглюкомутаза была стабильна при 85 °С. Такая высокая термоустойчивость этих ферментов — одно из характерных свойств экстремально-термофильных бактерий. Эти ферменты играют важную роль в регуляции углеводного обмена при высоких температурах. Среди различных гидролитических ферментов, выделенных из термофильных микроорганизмов, развивающихся при 55—65 °С, наиболее изучена α-амилаза. Она не инактивируется после 24-часовой выдержки при 65—70 °С. Активность этого фермента утрачивалась на 29% от первоначальной лишь после суточной выдержки при 85 °С. Высокая термостабильность а-амилазы обусловлена повышенным содержанием ионов кальция в ее молекуле, а также повышенной стойкостью к агентам, разрушающим водородные связи, а-амилаза была выделена из облигатно-термофильной бактерии Вас. circulans 186 с оптимальной температурой развития 56 СС и термотолерантного штамма Вас. subtilis 110 с оптимальной температурой развития 50 °С. Наиболее высокой термостабильностью обладает а-амилаза облигатно-термофильного штамма Вас. circulans 186. Инкубация этого фермента при 65 °С в течение 5 ч приводит к снижению активности на 85%. Полная потеря активности в этих же условиях наблюдалась у а-амилазы, выделенной из мезофильной культуры Вас. subtilis. Обнаружены различия в аминокислотном составе а-амилазы термофильных и мезофильных форм микробов. Содержание глютаминовои и аспарагиновой аминокислот в α-амилазах термофильных штаммов больше, чем в α-амилазах мезофилов. Как известно, эти аминокислоты могут легко связываться с ионами кальция. Многие исследователи предполагают, что кальций стабилизирует вторичную и третичную структуру α-амилазы. Было установлено, что существует зависимость между оптимальной температурой роста бактерий и молекулярной массой выделенной из них α-амилазы. Так, α-амилаза, выделенная из Вас. circulans штамм 186, имеет молекулярный вес около 17 000; у α-амилазы, выделенной из Вас. subtilis штамм 110 (с пониженным температурным оптимумом развития), молекулярный вес оказался 28 000—30 000; α-амилаза, выделенная из различных форм мезофильных бактерий Вас. subtilis, имеет молекулярный вес 48 000— 50 000. В настоящее время интенсивно изучаются особенности термостабильной протеазы. Проводятся глубокие исследования по изучению структуры и физико-химических свойств этого фермента, выделенного из различных форм термофильных микроорганизмов. Так, был выделен термофильный актиномицет Micromonospora vulgaris штамм 42, развивающийся при 53—55 °С и активно синтезирующий протеазу. Изучены условия культивирования актиномицета и свойства протеолитических ферментов, которые он синтезирует. Выяснилось, что протеаза имеет четыре оптимума, в зависимости от рН раствора. Полученные в чистом виде препараты нейтральных протеаз из культуры актиномицета обладали повышенной термостабильностью и отличались от нейтральных протеаз, выделенных из мезофильных микроорганизмов, рядом физико-химических свойств и специфичностью действия.. Из указанного препарата протеаз было выделено два гомогенных препарата, которые заметно отличались своими свойствами. Молекулярный вес одной из протеаз около 50 000, температурный оптимум роста 75 °С. Другая протеаза имела молекулярный вес около 30 000, температурный оптимум роста 62—65 °С. Наиболее высокой активностью обладала протеаза с молекулярным весом 50 000. Многие свойства облигатно-термофильных микроорганизмов закреплены наследственно, и эти формы не могут существовать при перенесении их в обычные температурные условия. Споры термофильных микроорганизмов обладают значительно большей термоустойчивостью, чем споры мезофильных форм. Предполагают, что повышенная устойчивость спор термофилов к высокой температуре объясняется увеличенным содержанием в них дипиколиновой кислоты, а также уменьшением отношения количества магния к кальцию. Отмечено увеличение содержания в спорах термофильной бактерии Вас. stearothermophilus липидов. Термофильные бактерии широко распространены в природе. Их можно выделить из почвы, торфа, ила, воды, компоста, навоза и т. д. Но не всегда эти организмы развиваются в термофильных зонах. Однако наиболее интенсивное развитие термофилов наблюдается в местах, подвергающихся воздействию высоких температур. Особенно это касается бактерий, которые не способны развиваться при температуре ниже 40 °С. Эти бактерии называются облигатно-термофильными, имеют температурный оптимум роста 55—65 °С и выше. В значительных количествах термофильные бактерии обнаруживаются в огородных и полевых почвах, куда они попадают в основном вместе с органическими удобрениями. Было показано, что в окультуренных почвах термофилов довольно много, а в необработанных почвах их почти нет. Эти наблюдения дали возможность использовать термофильные микроорганизмы в качестве показателей степени окультуренности почв. Однако термофильные микроорганизмы были обнаружены даже в почвах и водах Крайнего Севера. По сравнению с почвой такие субстраты, как сточные воды, компост, навоз, самонагревающиеся торф и сено, содержат большее количество термофильных бактерий. Самонагревание сена и торфа, которое иногда приводит к пожару, в значительной мере обусловливается развитием термофилов. Наличие термофильных микроорганизмов в кишечном тракте и экскрементах животных и человека отмечено многими исследователями. Интересно отметить, что такие продукты, как нефть и входящие в ее состав вещества, также могут усваиваться термофильными микроорганизмами. Широко распространены термофильные сульфатвосстанавливающие бактерии, оптимальная температура роста которых достигает 55—60 °С. Известны также термофильные бактерии, окисляющие различные соединения серы до молекулярной серы и серной кислоты. Горячие источники, богатые сероводородом, изобилуют термофильными видами тионовых бактерий. Из Брагунских терм (Северный Кавказ) с температурой 89—90 °С выделена тиобактерия Thiobacillus thermophilica Imschenetskii. Оптимальная температура роста этой бактерии 55 — 60 °С, максимальная — около 80 °С, минимальная 40 °С. С. И. Кузнецов в 1955 г. обнаружил, что в источниках Камчатки с температурой 90—98 °С развиваются термофильные бактерии. В 1967—1971 гг. американскими исследователями были выделены из субтермальпых вод с температурой 85—89 °С бактерии, не образующие спор, которые не способны развиваться при температуре ниже 40—45 °С, они относятся к виду Thermus aquaticus. Температурный оптимум развития этих бактерий 70—80 °С. Термофильные анаэробные бактерии рода Clostridium были обнаружены во всех обследованных пробах воды и почв, взятых в термальных зонах, а также в компостах.
